Il pesce zebra: un animale modello per la ricerca

Facciamo Progressi!

di Alessandro Alunni

 

Perché un piccolo pesce d’acqua dolce che vive in Asia è diventato, negli ultimi decenni, uno dei modelli di vertebrato più utilizzati nei laboratori di ricerca per gli studi su sviluppo, genetica e rigenerazione? Il danio rerio, conosciuto comunemente come danio zebrato o pesce zebra, deve il proprio nome alle strisce orizzontali presenti lungo il suo corpo.

Esso venne utilizzato inizialmente dai biologisti dello sviluppo, poiché ogni femmina è in grado di produrre, in una settimana, centinaia di embrioni che, oltre ad essere trasparenti, si sviluppano all’esterno della madre, permettendo così ai ricercatori di osservarli e facilmente manipolarli, grazie a tecniche non invasive. Il suo sviluppo è peraltro molto rapido: in soli cinque giorni la cellula diviene una larva completamente formata, capace di nuotare e di nutrirsi, e dopo tre mesi raggiunge la maturità sessuale.

L’interesse per questo animale è in seguito aumentato, quando nel 2001 il suo genoma fu completamente sequenziato e ci si rese conto che esso contiene il 75% dei geni umani, rendendolo un modello adatto per lo studio delle malattie dell’uomo. È infatti possibile, grazie ad esso, creare delle mutazioni di geni implicati in diverse patologie e studiarne i meccanismi. Un esempio di questo tipo di studio è quello che è stato effettuato con il gene della distrofina.

Oggi l’interesse scientifico per questo piccolo nuotatore delle acque dolci è dovuto soprattutto alla combinazione di due elementi: la facilità di manipolarlo geneticamente, e la possibilità di filmare le cellule sia negli embrioni che negli adulti. Manipolare geneticamente il pesce zebra è facile: le sue uova sono trasparenti ed è agevole iniettare del DNA quando è ancora allo stadio di una cellula. In tal modo è stato possibile creare migliaia di linee transgeniche in cui una proteina fluorescente permette di visualizzare l’espressione di un gene. Ancora una volta la trasparenza dell’embrione risulta essere un enorme vantaggio, poiché grazie a tecniche di microscopia sempre più performanti è possibile, ad esempio, filmare e quindi analizzare le prime 24 ore di sviluppo di questo vertebrato. Questo tipo di studio sarebbe impossibile, per esempio, nel topo, dove gli embrioni si sviluppano all’interno della madre e non sono trasparenti.

Recentemente è stato possibile visualizzare, in una larva di pesce zebra, l’attivazione dell’80% dei centomila neuroni presenti nel suo cervello. Per questo esperimento è stata usata la tecnica dell’optogenetica, che permette di inserire un gene per la produzione di una proteina fosforescente che si attiva quando un neurone è attraversato da un potenziale d’azione. Grazie poi all’utilizzo di un microscopio ad ampia fluorescenza è stato possibile visualizzare su un cervello intero l’attivazione dei neuroni in tempo reale. Ancora una volta questo tipo di analisi, nel topo, risulta molto più complicata, tanto da rendere necessaria la limitazione dell’analisi ad una piccola regione del cervello.

Altra caratteristica estremamente affascinante per i ricercatori è la capacità di questi piccoli pesci di rigenerare i loro organi (cuore, cervello, ecc), eleggendoli come il modello più utilizzato negli studi di rigenerazione dei tessuti.

Un modello per lo studio delle CSN adulte

Presso l’Istituto Pasteur, dove effettuo la mia ricerca, nel laboratorio diretto da Laure Bally-Cuif, ci interessiamo di cellule staminali neurali (CSN) del cervello.

Perché il pesce zebra è un modello interessante per studiare le CSN adulte? In tutti i vertebrati è stata evidenziata la neurogenesi adulta, cioè la presenza di CSN che producono delle cellule neurali. L’efficacia della neurogenesi, però, è molto diversa per ognuna delle specie studiate. Nei mammiferi la neurogenesi è molto limitata e presente solamente in due regioni del cervello anteriore, inoltre le cellule staminali si dividono raramente. Nel topo queste nuove cellule servono a generare dei nuovi neuroni che vanno nel bulbo olfattivo e sono necessarie nell’apprendimento. Nei pesci, invece, la neurogenesi è abbondante e presente in tutte le differenti regioni del cervello. Questa differenza è dovuta al fatto che i pesci crescono durante tutta la loro vita e di conseguenza anche i loro organi. Il cervello non fa eccezione e per crescere in maniera continua ha bisogno che nuove cellule neurali vengano prodotte durante tutto l’arco della sua vita. Noi ed altri ricercatori abbiamo dimostrato che nei pesci, come nei Mammiferi, le CSN sono delle cellule gliali e che le vie di segnalazione che le regolano sono conservate.

Per tutte queste evidenze il pesce zebra è un modello molto interessante per studiare i meccanismi che permettono la regolazione dell’omeostasi nel cervello adulto. Per poter comparare la regolazione delle CSN nel pesce con quella dei mammiferi abbiamo scelto di studiare la regione anteriore (telencefalo) del cervello del pesce zebra, che è omologa alla regione in cui risiedono le CSN nei mammiferi (Fig.1)

Fig.1 Immagine dorsale della parte anteriore del cervello del pesce zebra. In verde sono marcate le cNSC. Immagine gentilmente fornita da Nicholas Dray.

I nostri principali obiettivi di ricerca sono due:

1) Innanzitutto vorremo caratterizzare queste cellule da un punto di vista molecolare, sia a livello di popolazione che di singola cellula, ed in questo torna utile la facilità di avere delle linee transgeniche. Abbiamo infatti creato due linee transgeniche: una in cui tutte le cellule gliali sono visibili perché esprimono una proteina rossa, e un’altra in cui tutte le cellule in proliferazione esprimono una proteina verde. Incrociando queste due linee abbiamo ottenuto una linea transgenica in cui possiamo riconoscere le CSN quiescenti e le CSN in proliferazione. Una volta poi dissociate queste cellule, con la tecnica del FACS, abbiamo intrapreso uno studio sulla espressione dell’RNA (Fig 1). Questi risultati ci permetteranno di mettere in evidenza dei geni responsabili della regolazione dello stato quiescente e dei geni responsabili dell’attivazione delle CSN.

Da qualche mese abbiamo iniziato uno studio che ci permetterà di analizzare il contenuto in RNA di ogni singola CSN, ed i risultati ottenuti dovrebbero permetterci di mettere in evidenza all’interno di una stessa popolazione la presenza di più sottogruppi, per esempio un sottogruppo di cellule più pronte a dividersi ed un altro che rimane in quiescenza per molto tempo.

2) Il secondo aspetto che ci interessa è lo studio in vivo della divisione delle CSN. Questa analisi viene effettuata sulla stessa doppia linea transgenica e stiamo utilizzando una tecnica che ci permette di visualizzare le divisioni di queste cellule in tempo reale. Il ricercatore che si occupa di questo progetto, Nicholas Dray, ha scelto una zona del cervello anteriore in cui le cellule staminali sono presenti sulla superfice, e quindi facilmente accessibili utilizzando dei microscopi fluorescenti. Per facilitare la visione di queste cellule attraverso il cervello abbiamo utilizzato le nostre due linee transgeniche fluorescenti che ci permettono di identificare le cellule staminali in quiescenza (rosse) e quelle in divisione (verdi), incrociandole con un pesce in cui due mutazioni lo hanno reso completamente trasparente (casper). Grazie a un microscopio a fluorescenza molto sofisticato possiamo effettuare delle riprese in diretta del cervello dei pesci e visualizzare le divisioni cellulari ogni giorno e per diversi mesi. In questo modo possiamo osservare in tempo reale come queste cellule si dividono ed in quanto tempo lo fanno. Possiamo osservare inoltre se quelle che entrano in divisione siano scelte in modo casuale o piuttosto esistano dei segnali che stabiliscono quali ed in quale momento debbano dividersi. Ciò permetterebbe di comprendere meglio i meccanismi che regolano l’omeostasi nel cervello adulto di un vertebrato.

Il pesce zebra ha inoltre permesso di osservare, per la prima volta, la angiogenesi in un organismo, e di testare, in tossicologia, l’effetto di un prodotto su moltissimi embrioni, potendone analizzare rapidamente gli effetti.  

In conclusione, le future possibilità di ricerca in campo oncologico e le nuove speranze di diagnosi e guarigione di molte malattie, rendono questo pesciolino a strisce un prezioso e colorato alleato.